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PCD-007 光化學柱后衍生器
——提高黃曲霉毒素檢測靈敏度和重復性的利器
成都摩爾科學儀器有限公司
目錄
1 黃曲霉毒素的危害 ........................................................................................................................ 1
2 黃曲霉毒素的檢測方法 ................................................................................................................ 1
3 黃曲霉毒素檢測所需試劑及耗材 ............................................................................................... 2
4 艾力析實驗科技有限公司研制的光化學柱后衍生器 ................................................................ 3
4.1 儀器介紹 ........................................................................................................................... 3
4.2 產品特點 ........................................................................................................................... 4
4.3 產品參數 ........................................................................................................................... 4
4.4 安裝使用 ........................................................................................................................... 4
4.5 常見故障及簡易排除方法 ................................................................................................ 4
4.6 注意事項及日常維護 ....................................................................................................... 5
4.7 黃曲霉毒素檢測的解決方案 ............................................................................................ 5
4.7.1 營養(yǎng)米粉類嬰幼兒輔食 ........................................................................................ 5
4.7.2 乳制品 ................................................................................................................... 7
4.7.3 糧油 ........................................................................................................................ 9
4.7.4 花生及其制品 ..................................................................................................... 11
4.7.5 飼料 ..................................................................................................................... 13
4.7.6 中藥材 ................................................................................................................. 15
4.8 磺胺類藥物的檢測 .......................................................................................................... 17
4.9 其他應用 ......................................................................................................................... 18
1 黃曲霉毒素的危害
黃曲霉毒素是一組化學結構類似的二呋喃香豆素的衍生化合物，可以由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽滯曲霉產生。黃曲霉毒素常常存在于發(fā)生霉變的中藥材、谷物、農作物、堅果、奶制品以及動物飼料中等相關的產品中。其中 B1、B2、G1、G2易污染多種農作物、食品、飼料及中藥材。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究結構（IARC）劃定為 I 類致癌物，是一種毒性極強的物質，其毒性是氰化鉀的 10 倍，其中以 B1毒性zui大。當人攝入量大時，可發(fā)生急性中毒，出現急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。當微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。
2 黃曲霉毒素的檢測方法
黃曲霉毒素是當前食品及藥品中污染zui嚴重的真菌毒素之一。因此，GB/T 2761-2011嚴格規(guī)定了各類食品中的限量，zui低限量值是 0.5μg/kg,所建立的檢測方法必須達到 0.05μg/kg 的zui低定量限才能滿足限量的檢測。同時在 2015 版藥典七大變化之一安全性控制項
目大幅提升中，明確規(guī)定并強制推行中藥材中黃曲霉毒素的限量檢測。對《中國藥典》收載的柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等 14 味藥材及其飲品品種項下增加“黃曲霉毒素”檢查項目，限度為“黃曲霉毒素 B1不得超過 5μg/kg;黃曲霉毒素 B2、黃曲霉毒素 G1、黃曲霉毒素 G2總量不得超過10μg/kg”。目前，對食品和中藥材中黃曲霉毒素的檢測方法主要有：薄層色譜法（TLC），酶聯免疫吸附法（ELISA）,親和層析法（AFTB1）、免疫親和-液相色譜法（HPLC 法）及液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）。其中將免疫親和柱與高效液相色譜法結合應用，由于其前處理方法簡單、儀器使用成本相對較低、可異構體分離、分離靈敏度高、穩(wěn)定性好等******性，近年來已經得到廣泛的應用。由于黃曲霉毒素 B1、G1采用液相色譜熒光檢測直接檢測時易發(fā)生猝滅而導致靈敏度較低，因此需要對其進行衍生后才能達到痕量檢測的要求。現行的黃曲霉素檢測采用的衍生方法主要分為柱前衍生（TFA 柱前衍生）和柱后衍生法（光化學柱后衍生、溴和碘柱后衍生）。采用 TFA 柱前衍生法，雖然檢測靈敏度高，但需要用到有毒有害試劑（三氟乙酸、正己烷），且操作較其他幾種方法繁瑣；溴和碘柱后衍生法，在
樣品預處理上相對較簡單，但檢測時需配備傳統(tǒng)的柱后衍生裝置，同時需要手動品配制衍生液，而不同人手動配制的衍生液的濃度會存在差異，從而導致待測物質保留時間穩(wěn)定性較差。而光化學柱后衍生法在操作上相對簡單，樣品經過處理后可直接進樣分析，減少了有機試劑的接觸；且有效提高黃曲霉毒素檢驗靈敏度和重復性;此外光化學柱后衍生器較傳統(tǒng)的柱后衍生裝置成本低，且檢測靈敏度較溴和碘柱后衍生法理想。
4.2 產品特點
（1）無需使用化學物質（節(jié)約成本的同時，也避免操作人員接觸有毒化學物質）；
（2）較傳統(tǒng)柱后衍生裝置（化學衍生泵、混合器、溫控裝置）成本低；
（3）直接連接于色譜柱與熒光檢測器之間，安裝操作簡單；
（4）外觀設計精巧細致，節(jié)省實驗室空間；
（5）******采用進口配件，******了產品的使用性能；
（6）采用 PHILIP 進口紫外燈光源，使用壽命長達 8000h；
（7）采用專利的支架和管線纏繞方式，******了反應效率；
（8）可與國內外各種品牌及型號的熒光檢測器聯用；
（9）無腐蝕性酸流經毛細管，增加 HPLC 儀器的壽命；
（10）可持續(xù)工作數千小時，用后無需沖洗步驟；
（11）黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的zui低檢測限均小于 0.5 ppb；
（12）符合 AOAC 2005.08, AOAC 2008.02,AOCS Aa 11-05 ，中國臺灣標準（食
字 0981800370 號公告）和歐盟藥典 2.8.18 標準分析方法要求；
（13）符合中國國家標準和進出口檢驗標準及 2015 版中國藥典要求（增訂光化學衍生法）；
4.3 產品參數
設備尺寸：411mm×53mm×68mm（長×寬×高）
凈重： kg
毛重： kg
管線有效長度：25m
出入端管線長度：≤500mm
紫外燈壽命：≥4000
工作電源：220V、50Hz
工作功率：11W
環(huán)境溫度：0~45℃
環(huán)境要求：嚴禁浸水、淋水，內含易碎物質避免沖擊及跌落。
4.4 安裝使用
（1）將衍生器上的聚四氟乙烯管，用配套規(guī)格的的 PEEK 接頭，一端連接色譜柱，一段連接檢測器，無連接方向要求
（2） 啟動 HPLC 恒流輸液泵并且流量壓力均穩(wěn)定后，檢測各連接器件有無漏液情況，確定無誤通電并打開電源開關（正面綠色自鎖開關），系統(tǒng)進入紫外燈管預熱狀態(tài)。此時紫外燈點亮并預熱，大約 10min 光線穩(wěn)定后即可正常衍生反應。
4.5 常見故障及簡易排除方法
（1）儀器安裝完畢后，務必開啟高壓泵經過 1~2min 恒壓運行，用濾紙檢查儀器前后連接件確定無漏液后再開啟電源使用，漏液應及時清潔，避免流動相溶劑對設備的腐蝕。避免環(huán)境影響，縮短平衡時間。
（2）請匆自行拆開儀器或任意改變溫度控制器的內部設置，普通用戶對于復雜的系統(tǒng)參數設置不熟悉時盡量使用出廠默認值或儀器自動設定值，如有問題請及時與本公司聯系。
（3）儀器通電衍生后，出峰變小或異常峰；燈管光照不足或燒壞，使用備用系統(tǒng)或返廠更換維修；上述問題您無法解決時，請與經銷商或廠家聯系。
4.6 注意事項及日常維護
（1）使用前請檢查電源插座是否良好接地，若沒有請用線接好背面保護地線！柱大量漏液時可能對電氣有腐蝕作用，長期腐蝕可能引起漏電，造成事故損失，因此請確保儀器良好接地。
（2）應保持柱箱部件的清潔，不用時請切斷電源。
（3）嚴禁非維修人員拆解儀器，內有紫外光線，請勿直視漏光部位。
（4）燈管為專用燈管，更換時請務必確認切斷電源。
（5）儀器自然散熱，工作中請******通風，勿覆蓋影響散熱。
4.7 黃曲霉毒素檢測的解決方案
4.7.1 營養(yǎng)米粉類嬰幼兒輔食
嬰幼兒正直身體發(fā)育時期，應該營養(yǎng)均衡搭配，提倡給嬰幼兒吃大自然提供給人類的各種食物。而在這些食物中，嬰幼兒米粉（稱“嬰幼兒配方谷粉”、“營養(yǎng)米粉”或“嬰幼兒米糊”），是母乳或嬰兒配方食品不能滿足嬰兒營養(yǎng)需要以及嬰兒斷奶期間時，為補充嬰幼兒營養(yǎng)的非常重要的輔助食品。由于營養(yǎng)米粉以小米、大米為主要原料，而小米和大米若儲藏不當，******容易受到黃曲霉毒素的污染。據不******統(tǒng)計，2015 年以來，國家食藥監(jiān)總局共公布了 64 批次存在食品安全風險的嬰幼兒輔食，其中黃曲霉毒素等污染物超標達 15
批次。因此，企業(yè)和國家質檢部門有必要加強對嬰幼兒輔食中霉菌毒素的檢測與監(jiān)管，保障嬰幼兒食品的安全。
針對嬰幼兒營養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素 B1 的檢測，青島艾力析實驗科技有限公司為您提供了整套解決方案。滿足我國嬰幼兒食品中黃曲霉毒素 B1(GB2761-2011)的限量標準 0.5μg／kg 的要求。
（1）色譜條件
色譜柱：Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—水 （55/45，v/v）
柱溫：25℃
流速：0.8mL/min
進樣量：20μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發(fā)波長）=360nm,EM（發(fā)射波長）=420nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統(tǒng)：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 25.000g 樣品于 500mL 的具塞玻璃容量瓶中，加入 125mL 甲醇-水(體積比為 70∶30)溶液；
? 在高速勻質機上勻質 2～3min；
? 取 30mL 左右勻質后的樣液以 4000r／min 離心 5min；
? 取上層清液 10mL 加入 30mL 水稀釋，搖勻后過玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液全部轉移到 10mL 玻璃注射器中，調節(jié)固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2 滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：******加入2.0mL流動相至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的B1洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1 的濃度；圖 3 為嬰幼兒營養(yǎng)米粉中黃曲霉毒素 B1 樣品檢測及加標樣品檢測疊加譜圖。
（1）色譜條件
色譜柱：Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—乙腈—水 （25/20/55，v/v）
柱溫：30℃
流速：1.0 mL/min
進樣量：20μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發(fā)波長）=355nm,EM（發(fā)射波長）=430nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統(tǒng)：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 2.0000g 奶粉樣品，置于 50mL 的離心管中。將 20mL 已預熱到 50℃的水加入到奶粉中，邊加邊振搖至奶粉******溶解；
? 在渦旋混合器上振蕩 2min 混合均勻；
? 將奶粉乳濁液冷卻至室溫后，于 10000r/min、在-5℃下離心 10min；
? 取 30mL 左右勻質后的樣液以 4000r／min 離心 5min；
? 將樣品溶液用玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液全部轉移到 10mL 玻璃注射器中，調節(jié)固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2 滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：******加入1.0mL流動相至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的B1洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,用水定容到2mL。于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1 和 M2 的濃度；圖 4 為 6 種黃曲霉毒素同時檢測的色譜圖。
（1）色譜條件
色譜柱： Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—水 （50/50，v/v）
柱溫：30℃
流速：1.0 mL/min
進樣量：20μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發(fā)波長）=360nm,EM（發(fā)射波長）=440nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統(tǒng)：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 25.000g 糧、油樣品于 500mL 錐形瓶中，加入 5g 氯化鈉、加入 125mL甲醇水(體積比為 70∶30)；
? 在高速勻質機上勻 20mL 水稀釋，搖勻后過玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液全部轉移到 10mL 玻璃注射器中，調節(jié)固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2 滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：******加入1.0mL甲醇至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的B1洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,加入1.0mL純水于洗脫液中，于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的濃度；圖 4 為各樣品檢測色譜圖。
（1）色譜條件
色譜柱：Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—水 （55/45，v/v）
柱溫：25℃
流速：0.8mL/min
進樣量：50μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發(fā)波長）=360nm,EM（發(fā)射波長）=420nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統(tǒng)：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 25.000g 粉碎樣品于 500mL 的錐形瓶中，加入 125mL 甲醇-水(體積比
為 70∶30)溶液；
? 在高速勻質機上勻質 2～3min；
? 取 30mL 左右勻質后的樣液以 4000r／min 離心 10min；
? 用槽紋濾紙過濾試樣溶液于 50mL 量筒中；
? 收集濾液 15mL，加入 30mL 二次去離子水，混勻，將稀釋后的濾液用玻璃纖維濾紙再次過濾。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液 15mL 轉移到玻璃注射器中，調節(jié)固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 去離子水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：加入1.0mL甲醇至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,并加入1mL去離子水，于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的濃度；圖 6 為花生粉樣品添加 1.5μg/kg 水平的色譜圖。
根據 GB/T 30955-2014 中飼料中黃曲霉毒素的檢測方法，青島艾力析實驗科技有限公司提供完整的解決方案。
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